Методы определения перестроек гена ALK

 

 

Основные методы определения перестроек гена ALK представлены на рисунке 1.

 

Рисунок 1. Методы определения перестроек гена ALK [1]

 

Метод FISH в настоящее время является «золотым стандартом» скрининга для определения транслокаций с участием гена ALK. Основными преимуществами являются: возможность выявлять все известные виды транслокаций вне зависимости от типа разрыва и гена-партнера, использование материала, прошедшего фиксацию в формалине и заливку парафином.  Основным недостатком метода является его высокая стоимость. Средняя цена обследования одного больного в странах Европы и России составляет 200 Евро.

 

Типичная картина при проведении FISH выглядит следующим образом: слитный сигнал определяется  на неперестроенной хромосоме, на второй хромосоме определяется типичное расхождение красного и зеленого сигнала более чем на 2 диаметра. В ряде случаев инверсия 2 хромосомы сопровождается делецией части гена  ALK и потерей одного зеленого сигнала.

 

Рис 2. Перестройка гена при немелкоклеточном раке легкого (аденокарцинома). Собственное наблюдение лаборатории молекулярной диагностики МГОБ №62.

 

Могут наблюдаться и следующие варианты [2]

С – потеря зеленых сигналов на перестроенной хромосоме за счет делеции части последовательности гена ALK                

D -  образование кластеров за счет увеличения числа копий перестроенного гена. 

 

При оценке результатов гибридизации необходимо учитывать, в первую очередь, что количество клеток с перестроенным сигналом далеко не всегда составляет 100%. Общепринятым пороговым значением является 15% клеток с расщепленным сигналом. Следует учитывать, что небольшое количество клеток, симулирующих реарранжировку, могут образовываться за счет разрушения ядра в процессе резки препарата или дефектов методики.

 

Иммуногистохимический метод весьма привлекателен для первичного скрининга в связи с его относительной простотой и дешевизной. Однако в настоящее время коммерчески доступны только антитела, созданные для детекции химерных белков ALK при анапластической лимфоме. Чувствительность этих антител для определения химерного протеина EML4-ALK в стандартных протоколах не очень высока [3]. Большие надежды возлагаются на новое антитело, клон D5F3, разработанное компанией Cell Signaling и показавшее хорошие результаты в предварительных исследованиях. [4]. Скорее всего, после проведения крупных проспективных исследований, именно метод ИГХ станет основным для первоначального скрининга. В настоящее время использование ряда модификаций позволяет части лабораторий применять ИГХ, однако, чаще – в виде вспомогательного метода.

 

Рис.3 Имуногистохимическое исследование

 

ИГХ ИНДЕКС

                  0                          +1                         +2                          +3

 

 

Третьим методом, используемым в диагностике реарранжировок ALK, является обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). Метод обладает  высокой чувствительностью, позволяет работать с образцами, содержащими крайне низкое количество опухолевых клеток, способен сразу идентифицировать тип перестройки.[16]  Тем не менее, ОТ-ПЦР обладает несколькими весьма существенными недостатками. Во-первых, метод очень требователен к качеству РНК, выделенной из образца, в особенности – из фиксированного в формалине и залитого в парафин. Во-вторых, с помощью ОТ-ПЦР возможно выявить только те типы перестройки гена ALK, к которым подобраны специфические праймеры, что требует мультиплицирования исследования и существенных временных затрат.

 

В ходе «Программы совершенствования молекулярно диагностической диагностики в РФ»  предоставляется  возможность выявления   ALK–транслокации  методом FISH-тестирования, как единственного  метода одобренного FDA [13], Международной ассоциацией по изучению рака легкого (IASLC) и Ассоциацией молекулярных патологов (США).[17]

 

Очевидно, что проводить исследование необходимо после установления гистологического диагноза аденокарциномы или смешанного адено-плоскоклеточного рака.      Правильно проведенная селекция позволяет уменьшить количество обследуемых больных и увеличить процентное соотношение пациентов с выявленной транслокацией. Так, по данным Camidge и соавт[18].   при отборе аденокарцином без мутаций EGFR  и KRAS, количество случаев с перестройкой гена ALK может возрасти до 26% (13 больных из 50).  

 

В рамках Программы алгоритм диагностики по выявлению транслокации ALK  у пациентов  с немелкоклеточным раком легкого представлен на  рис.3.

 

Рис 3. Алгоритм диагностики

 

 


Последняя новость:

Информируем Вас, что с 07 ноября 2016 года Программа «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации» расширяется

Читать подробнее