Протоколы контроля качества

Подготовлено И.А. Демидовой

1. Материал – 15 образцов FFPE, содержащих опухолевую ткань в количестве от 50 до 15%.

С каждого блока делается 3 неокрашенных и одно окрашенное Г.Э. стекла со срезами (5 микрон) – всего сет из 60 стекол.

Окрашенные стекла используются для определения валидности образца и маркировки зоны, содержащей опухолевую ткань, с целью макродиссекции (при необходимости). Валидность образца для исследования и % опухолевой ткани заносится в таблицу 2.

PS. Желательна предварительная валидация образцов во второй лаборатории референсного класса.

2. Выделение ДНК.

Требования к выделению ДНК – используется реагентика, зарегистрированная в РФ для работы с тканями, фиксированными в формалине и залитыми в парафин, название набора фиксируется в таблице 1. Проводится измерение концентрации ДНК с указанием типа измерительного оборудования. Результаты заносятся в таблицу 2.

3. Генотипирование.

Непосредственно генотипирование – используются наборы реагентов, зарегистрированные для определения мутаций гена EGFR в РФ, и применяемые лабораторией в реальной практике. Название набора заносится в таблицу 1.

4. Результат генотипирования.

Предполагается фиксация только обнаруженных мутаций (со ссылкой на референсную последовательность), в той форме, в какой она производится в реальной практике, оптимально – с использованием номенклатуры HGVS по ДНК и протеину. Результат для всех исследованных образцов вносится в таблицу 2.

5. Формирование заключения.

Для 3 образцов предлагается формирование стандартного заключения, предлагаемого лабораторией клиницисту.

Оценивается соответствие заключения правилам GLP, обязательное указание используемой реагентики и оборудования, интерпретация результата.

При необходимости – предлагаемые правила формирования ответа могут быть предоставлены.

Таблица 1. Общие сведения о лаборатории.

Таблица 2. Результаты контроля.

Результаты отсылаются в 2 экспертные лаборатории, оценка проводится по каждому из пунктов, максимальный результат по каждому образцу – 2 балла, максимальный общий результат – 30 баллов.

Баллы снимаются:

1. за грубые ошибки, приведшие к неправильному генотипированию и неверной трактовке результата – 2 балла полностью за соответствующий образец;
2. за методические ошибки, приведшие к невозможности проведения исследования на валидном образце, сертифицированном двумя референсными лабораториями – 1 балл за соответствующий образец;
3. за ошибки в номенклатуре, неверное использовании референсных последовательностей, игнорирование обязательных пунктов в формировании заключений – 0,5 балла за каждый образец.

Удовлетворительным считается результат, превышающий 25 баллов.

Подготовлено М.Л. Филипенко

Часть 1. Оценка частоты и спектра соматических мутаций в гене PIK3CA на собственных биообразцах лаборатории.

В исследовании участвуют биообразцы пациенток с гормоно-рецепторо-положительным HER2-отрицательным распространенным раком молочной железы. Поля для заполнения лабораторией такие же, как и в карте пациента при РМЖ в Базе данных.

• Материал анализа – гистологические блоки операционный материал/гистологические блоки биопсия
• Метод определения мутации:
• AS-PCR PIK3CA therascreen^® PIK3CA RGQ (Qiagen)
• AS-PCR cobas^® PIK3CA Mutation Test (Roche Diagnostics)
• AS-PCR "in house" (набор разработанный в лаборатории), обязательно указание списка тестируемых мутаций
• Секвенирование по Сенгеру, обязательно указание списка тестируемых экзонов гена PIK3CA
• Высокопроизводительное секвенирование, обязательно указание списка тестируемых экзонов гена PIK3CA
• Результат исследования – статус мутации в гене PIK3CA
• Мутация не выявлена
• Мутация выявлена (привести название выявленной мутации или ND, если точно определить тип мутации невозможно из-за особенностей диагностической системы)

Часть. 2. Внешний контроль качества PIK3CA.

Для проведения внешнего контроля качества выбираются 20 гистологических блоков с операционном материалом РМЖ HR(+) HER2(+) с характеризацией соматических мутаций в гене PIK3CA по крайней мере двумя независимыми методами: NGS и AS-PCR.

В качестве аналитических методов отбора клинических образцов для программы «Внешний контроль качества PIK3CA» предлагаются:

• Первичный анализ около 100 гистологических блоков с операционным методом высокопроизводительного секвенирования с использованием панели «COMMON CANCER», позволяющей определять соматические мутации в 1, 2, 3, 4, 7, 9, 20 экзонах гена PIK3CA.
• Подтверждение наличия выявленных соматических мутаций (из списка E542K c.1624G>A, E545K c.1633G>A, E545A c.1634A>C, E545G c.1634A>G, E545D c.1635G>T, Q546K c.1636C>A, Q546E c.1636C>G, Q546R c.1637A>G, Q546L c.1637A>T, M1043I c.3129G>T, H1047Y c.3139C>T, H1047R c.3140A>G, H1047L c.3140A>T, G1049R c.3145G>C, R88Q c.263G>A, N345K c.1035T>A, C420R c.1258T>C) с помощью AS-PCR cobas^® PIK3CA Mutation Test (Roche Diagnostics).

В результате будет выбрано 10-12 блоков с подтвержденными соматическими мутациями в гене PIK3CA и 8-10 блоков с доказанным отсутствием соматических мутаций в этом гене.

Для приготовления контрольной панели для каждого блока будет приготовлено 18 стекол с одним 5 μm срезом с клеточной областью размером 3-8 mm для окраски гематоксилин-эозином и оценки препаратов.

В число задач, предлагаемых для решения лабораторией, будут входить:

• окраска срезов (стекло с одним срезом) гематоксилин-эозином, оценка препарата, гистологическое заключение с определением процента опухолевых клеток;
• выделение ДНК (два стекла с двумя неокрашенными срезами), прямое или с использованием макродиссекции по решению лаборатории;
• определение отсутствия или наличия мутации с указанием ее типа, ND – образец не валиден для анализа, описать причину.

Комментарии к результатам тестирования контрольной панели

Образец 3. Результат – ND. Причина – недостаточное количество выделенной из препарата ДНК.